灌流培养中如何选择正确的截留设备和中空纤维柱

细胞灌流培养是一种不断添加新鲜培养基以满足细胞生长对于营养物质的需要，同时移除乳酸等对细胞生长有害代谢产物及营养耗尽的培养基的细胞培养方式。与传统的批次以及补料批次培养工艺相比，灌流培养可以有效地提高细胞密度及活率，延长细胞的培养时间，并获得更高的产量，因此越来越受到人们的青睐。

如何正确选择细胞截留装置

为了保证灌流过程中收获液及时排除的同时细胞可以被截留在反应器中，细胞的截留装置自然也成为了灌流培养中一个不可或缺的重要部分，细胞截留装置的正确选择也是灌流培养是否可以成功的一个重要因素。好的截留装置应该是既保证高效细胞截留又不能对细胞造成伤害，同时又可以长期稳定的运行；另外，从工业化生产角度出发，该细胞截留设备还应具有很好的放大的可能性。

随着灌流培养技术的发展，细胞截留设备也同样经历着不断的改变与创新，目前的细胞截留装置主要是基于过滤、沉降、超声、离心等原理设计的。对于 WAVE 波浪式生物反应器来说，基于膜过滤设计的内置细胞截留膜是一种良好的细胞截留方式，因为设备本身的波浪式运动即可对截留膜进行冲洗，可以有效的防止因为膜的堵塞而造成的灌流培养失败。而对于大规模的罐式反应器来说，由于自身不能对膜进行有效的冲洗，再加上灌流培养细胞密度高、培养周期长等因素，常规的膜截留方式很容易被细胞、细胞碎片或消泡剂等堵塞，造成灌流培养的失败。使用基于离心原理的连续流离心机对细胞进行截留，截留效果会受到灌流速率的影响，同时也可能会引起较大的细胞损伤，使培养因为细胞活率下降而停止。其他一些截留装置也因为截留效率、可放大性以及对细胞的伤害等因素没有在灌流培养中得到大范围的应用。相比之下，基于中空纤维切向流过滤原理而设计的截留装置，因其对细胞截留率高、对细胞伤害小、操作方便及易于放大等优点，在目前的细胞灌流培养中得到了广泛的使用。

目前常用的中空纤维切向流过滤的细胞截留装置主要有切向流过滤 (Tangential flow filtration，TFF) 和交替式切向流 (Alternating tangential flow，ATF)两种 。相比较来说，切向流过滤（TFF）的方式出现较早，液体的运动方式也更加直观简洁，但由于传统的 TFF 使用蠕动泵进行液体输送，蠕动泵产生的剪切力会对细胞造成较大的伤害，使细胞活率下降的同时产生的细胞碎片也容易堵塞中空纤维滤膜，因此早期的切向流过滤（TFF）在灌流培养中并没有表现出良好的效果。之后出现的交替式切向流过滤（ATF）则采用了隔膜泵进行液体驱动，降低了剪切力对于细胞的伤害，提高了细胞活率以及灌流培养时间，得到了较广泛的使用。而Wang S等[1]的研究已经表明，传统的 TFF 造成细胞活率下降以及膜堵塞的原因是蠕动泵带来的高剪切力对于细胞的伤害，如果将 TFF 中使用的蠕动泵换成了低剪切的离心泵进行相同的细胞培养，那么 TFF 和 ATF 在细胞密度、细胞活率以及产量上的表现一致，因此改良后的 TFF 也是一种良好的细胞截留装置。另外Clincke M F等[2]的研究表明，对于超高密度的灌流培养，TFF 会更具有优势，因为相比于用气体驱动的隔膜泵来说，离心泵往往会有更大的驱动力。

改良后的 TFF 与 ATF 比较， A）VCD、B）LDH 检测的特异性细胞死亡率、C）活率、D）产物滤过

如何正确选择中空纤维桩

细胞截留装置确定以后，中空纤维柱的选择也是灌流培养的重点之一。灌流培养可以分为多种类型，如经典的稳态灌流、N- 1种子灌流、浓缩灌流以及灌流和批次补料相结合的培养方式等。不同的灌流培养方式对于中空纤维膜的要求也不尽相同。如经典的稳态灌流方式，多使用 0.22 μm 或 0.45 μm 的截留孔径，这种截留孔径将细胞截留在反应器内的同时不会截留目的蛋白，目的蛋白会随着收获液一同流出，这种灌流方式非常适合于目的蛋白不稳定的产品，因为蛋白会一直随着收获液排除而不会停留在反应器中。而像浓缩灌流培养方式一般会使用超滤膜柱，如 50KD 孔径的膜柱，这种截留膜可以将培养的细胞以及目的蛋白一同截留在反应器内，待培养结束后统一进行收获。另外，从成本的角度，中空纤维柱的材质、是否可高温灭菌也应加以考虑。有些膜柱不支持高温灭菌仅可以一次性使用，这样也是成本增加的一个重要因素。

Xcellerex APS系统外观组件

Cytiva 推出的 Xcellerex APS 自动灌流系统是基于切向流技术 ( TFF )，应用于上游灌流工艺中的自动化设备。该系统采用低剪切力离心泵进行液体传输，将剪切力对细胞的影响降到最低。单台 APS 即可支持 50 - 500L 规模的 Xcellerex XDR 生物反应器，并可实现包括经典稳态灌流培养，浓缩灌流培养，以及 N- 1 灌流培养等的多种灌流培养模式。APS 系统中整合了多个蠕动泵及传感器，可实现两根中空纤维柱的自动切换、培养基储罐的自动切换以及自动 cell bleeding 等等，保证了培养过程的稳定与安全。此外，APS 的控制界面完全整合进 XDR 反应器的控制系统中，控制系统对 APS 及反应器进行统一的设置、控制、数据记录及导出，是真正方便、简洁、自动化且易于放大的灌流设备。同时 Cytiva 拥有各个规格的中空纤维柱，孔径均一性高、物理耐受性好且可重复使用，可满足各种灌流工艺对于中空纤维的要求。

1、经典 STR 反应器的灌流培养工艺的建立

? 经典灌流细胞培养体系的构成要素

? 灌流细胞培养工艺参数建立

? 灌流培养特有工艺参数介绍及建立

2、Small Scale 在灌流工艺研究中的应用案例分析

? 摇管/摇瓶培养半连续培养

? 微型生物反应器半连续培养

3、Wave 反应器的高密度灌流培养案例分析

? 自体膜过滤截留灌流培养工艺案例

? 外置 ATF/TFF 灌流培养工艺案例

参考文献：

[1] Wang S , Godfrey S , Ravikrishnan J , et al. Shear contributions to cell culture performance and product recovery in ATF and TFF perfusion systems[J]. Journal of Biotechnology, 2017, 246(Complete):52.

[2] Clincke M F , C M?lleryd, Ye Z , et al. Study of a recombinant CHO cell line producing a monoclonal antibody by ATF or TFF external filter perfusion in a WAVE Bioreactor?[J]. Bmc Proceedings, 2011, 5(S8):P105.

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