精液质量和人工授精 蜂王表现之间的关系

蜜蜂精液贮存技术的发展，大大提高了我们选择和保留优良蜜蜂品系的能力。用各种不同的检测方法，如精子活力测定、受精囊内精子数的测定以及人工授精蜂王后代工蜂和雄蜂蛹的比例测定等来评价精液的贮存质量。 目前采用染色法直接评价精子的存活率已经应用于蜜蜂，但该法只能表明精子缺乏活力并不能说明精子已经死亡，也不能确定存在于受精囊中的精子是否为活精子。工蜂和雄蜂蛹的比例不能反应受精囊中活精子的实际比例。精液贮藏技术的成功与否由蜂王产生足够数量的工蜂能力的大小来决定，因此，我们对精子活力和授精蜂王的表现之间的关系进行了研究。

一、方法 1、精液采集 从大量雄蜂收集 100 μL 精液，加到 1.4mL 的缓冲液中，并放入一个灭菌的 Eppendorf 中，上下轻轻倒置使其混合。然后放入 100 转离心机中离心 30分钟，使精液集中。将离心后的精液收集在无菌毛细管中用塑胶封口，一半毛细管室温下过夜贮存，其余则置于-80℃低温精子冷冻致死。 2、精子活力的评价 用 SYBR-14 和碘化丙啶（PI）对 2 份 2μL 新鲜精液样品进行染色，这种双重荧光染料能与精子头部的 DNA 结合，呈绿色的是活精子，呈红色的为死精子。将这 2 份精液每份分成四部分，并将其置于载玻片上；采用装有异硫氰酸荧光素（FITC）滤光片的荧光作光源 ，并在 400 倍显微镜下观察计数载玻片中每 100 个精子细胞中染色精子的个数。 按不同比例将新鲜精液和冷冻精液混合（即新鲜和冷冻精液比例分别为 100%∶0，75%∶25%，50%∶50%，25%∶75%），分别对来自同一育种场的处女王进行人工授精，每个处理注射 6 只处女王，每只注射 8μL。人工授精之前，从混合精液中每组取出 2份，并从 100 %的新鲜精液中取出 1 份，留作对照。 3、子脾的评价 人工授精 24~25 天后，检查蜂王并对子脾进行评价。利用目测法对发育中的工蜂和雄蜂进行测定，采用典型的方格网测子框（每一格 100 个巢房）对所有子脾进行测定。从相同的 100 个巢房中观察空房数，以此来确定空房率。 4、蜂王的解剖 人工授精 27 天后，切开每只蜂王的受精囊，分别放入装有 500μL 精液缓冲液的无菌 Eppendorf中，用研棒捣碎。对释放的精液进行染色并测定其活力，如前所述的计数方法计数，每个蜂王计数 2次。对照来自同一育种场提供的 5 只自然交尾王，解剖这些蜂王，评价其受精囊内的精子活力。

二、结果 1、精子质量 全部注射冷冻致死精液的蜂王受精囊内未发现活精子的存在；除新鲜精液比例为 25 %的处理组精子成活率极显著的低于自然交尾蜂王精子存活率外，4 组均显著低于对照蜂王的精子存活率。新鲜精液比例为 100 %的处理组活精子的比例 只占65.1%，其余混合组分别为 55%、42.6%、32.2%和0%。精子活力的降低可能是由于收集精液、混合精液以及授精过程等处理造成的。对新近收集、未混合他物的新鲜精液立即进行测定，通常活精子的值能达到 90%或更高。奇怪的是，授精前混入较少的新鲜精液（25%和 50%）与授精 27 天后受精囊中较高的活精子比例具有一定相关性。 然而，我们无法统计受精囊中的精子数，而是记录染色精液样品中精子细胞数的相对浓度，2/3的 25%处理组的蜂王和 3/5 的 50%处理组的蜂王受精囊中活精子细胞数少于 100 个，因此，这些蜂王的受精囊内只有较低数量的活精子的存在。 2、子脾质量 注射新鲜精液的比例为 50%或大于该值的蜂王比注射 25%和 0%的两组有较多的子脾。前者所有子脾 100%为工蜂蛹，平均空房率约为 20%。全部注射冷冻死亡精液的蜂王只产雄蜂，通常是一小块，并留下两倍产卵面积的空房。注射只有 25%新鲜精液的蜂王，其子脾范围通常较小，但和第一组相似，平均有大约 20%的空房率。产雄蜂的 2 只蜂王的受精囊中只有较低的活精子浓度。

三、讨论 尽管混合精液的比例各不相同，但在人工授精27 天后，四个处理组的蜂王受精囊活精子的比例没有显著差异；在某种情况下，受精囊中的活精子集中在一起，蜂王并未全部清除所有的死精子，而注射最少活精子的蜂王却转移了最大比例的精子。 目前我们对蜜蜂生殖行为的理解是：蜂王与雄蜂交配后精子便朝输卵管壁移动，然后输卵管收缩并通过腹部传送一些精子到输精管口，一旦到达那里，精子便非常活跃的穿越狭窄的输精管到受精囊中，大多数精液实际上被清除。所有只注射死精液的蜂王的受精囊中没有精子存在，其受精囊和处女王一样透明，该结果和 Harbo 先前的冷冻精液观察实验相一致。尽管精液存在于处女王体内，但死精子并没有转运到受精囊中，这也支持了精子活力对精子向受精囊的转运至关重要这一结论。然而，Bresslau 提出，受精囊周围有一段肌肉呈弯曲状，该弯曲部分的肌肉囊的收缩抽动，使得受精囊管在精子进出阴道的转移中有“精液泵”的功能，从而支持了精子向受精囊的转移和受精囊内精子的释放都是用于受精的这一观点。在本研究中，虽然在受精囊中发现死精子的存在，但这只出现在有活精子和死精子混合的处理中，可能是活精子向受精囊转移过程中，对死精子“拖拉”的结果。实际上，当活精子比例较高时，大部分死精子被一起转运。当活精子的比例降低时，它们只能转运部分死精子。因此，我们不能肯定受精囊中的所有精子都有活力。 所有接受了更多活精子（新鲜精液比例大于或等于 50%）的蜂王，其后代全部为工蜂。这些只产工蜂的蜂王的每一个受精卵，只是释放了其受精囊内所容纳精子的 1/153000，该容量在开始产卵时包含30~35 个精子，而在有效产卵后则降为大约 20 个。四个处理组的精子平均活力为 64.7%，这意味着能有效用于受精的精子数为 13~26 个。据估计，一个卵子可能与 0~10 个精子结合。然而，可以推测，当给蜂王注射较低活力的精液后，将比正常的蜂王更快的变为“产雄蜂蜂王”。 注射含有 42.6%的活精子的精液 （新鲜精液比例为 50%）便能得到高质量的工蜂子脾，这一结果预示了低温成功保存精液的前景。Harbo 道，精子的存活率一般在 25%左右，如果精子存活率仅增加一成，则人工授精后蜂王在一段时间内将主要产受精卵。今后的研究将集中在提高精子存活率的精液贮存技术上，此外还要对注射活力降低后的精液以及蜂王产正常后代的持续时间进行研究。

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