RNA 凝胶电泳注意事项

资讯 2021-12-01 易泵网 手机阅读

RNA 凝胶是用Northern 印迹的方法来分析RNA 。mRNA 大约只占总RNA 的5% ，在溴化乙锭染色的胶上看不到，因此mRNA 必须用标记探针来检测。

＊样品制备

  • RNA 样品在电泳之前及电泳过程中必须是变性的，否则不能精确测定分子质量。变性是由甲醛与甲酰胺来完成的，也可用乙二醛和二甲亚砜或甲基苯（不推荐）。
  • MOPS 胶的样品缓冲液： 0.75ml 去离子的甲酰胺，0.15ml 10 x MOPS, 0.24ml 甲醛， 0.1ml 去离子的无RNA酶的水，0.1ml 甘油， 0.08ml 10% (W/V) 澳酚蓝。分装小管后贮于－ 20℃, 或者每次现配。
  • 加25 μI 样品缓冲液到5μ1 RNA 样品。可能需要浓缩RNA 样品。
  • 样品缓冲液中的样品在65℃ 加热15min。加1μl mg/ml 溴化乙锭到每个样品，混匀。不需要将溴化乙锭加到电泳缓冲液中。
  • 中型大小的胶，加5 ~ 20μg 总RNA, 小型胶加1~5 μg 。
  • 加3 μg mRNA 与加5 ~ 20μg 总RNA 样相比，会得到更清晰的信号。

    • ＊标准参照物／标记参照物

  • 需要标准参照。
  • 许多人利用样品本身的核糖体RNA作为大致的参照。真核生物核糖体RNA 是28S和18S （大致长5300 和2000 碱基）；原核生物核糖体RNA 是23S 和16S （大肠杆菌大致长3566 与1776 个碱基） 。
  • RNA 标准参照有商业制品。DNA 标准参照在甲醛胶中跑得不太好，不应使用。体外RNA 合成的指定模板可以用来合成长度确定的RNA 转录物，如果某未知RNA的长度必须要精确知道的时候可以采用。
  • 溴酚蓝和二甲苯腈蓝可以用来做指示染料。就像在DNA 电泳中一样，其确切的位置取决于琼脂糖的品质与浓度（见表1) 。

    • 表1 RNA 甲醛胶中跟踪染料的迁移

    甲醛胶

    二甲苯腈蓝

    溴酚蓝

    SeaKem Gold

    1.0%

    6300

    660

    1.5%

    2700

    310

    2.0%

    1500

    200

    SeaKem GTG 与LE

    1.0%

    4200

    320

    1.5%

    1700

    140

    2.0%

    820

    60a

    SeaPlaque SeaPlaque GTG

    1.0%

    2400

    240

    1.5%

    800

    80a

    2.0%

    490

    30a

    a 外推法确定的与染料迁移相当的核苷酸数。

    ＊样式

  • RNA 凝胶就像DNA 凝胶一样进行电泳。并不需要独立的胶盒与仪器。只要在电泳前后清洗胶盒就可以了。

    • ＊缓冲液

  • 10 x MOPS/EDTA 缓冲液，包含0.2mol/L MOPS (3 – 吗琳代丙磺酸）、50 mmol/L乙酸钠、10 mmol/ L EDTA, 调至pH7.0 。高压灭菌15min。时间长了呈现淡黄色是正常的。1 X 用于电泳。
  • MOPS 缓冲液（和其他RNA 缓冲液）离子强度很低，电泳过程中，沿着胶的长度方向会产生pH 梯度，导致胶的水解。只有在非常长的电泳过程中才可能出现，可以通过用蠕动泵循环缓冲液或者间歇性地把缓冲液从一端吸到另一端来避免这个问题。

    • ＊凝胶

  • RNA 必须在变性条件下电泳。MOPS－甲醛胶是最安全最好的一种。
  • 甲醛胶必须在通风橱内倒胶，并静待固化。热的甲醛会蒸发，吸入很危险。做之前要请别人指导。
  • 含甲醛的琼脂糖凝胶比普通琼脂糖凝胶易碎，必须小心操作。
  • 1％或者1.2 ％的胶适用于大多数Northern 印迹。

    • ＊电源

  • 对电源的要求同DNA 琼脂糖凝胶。对于中等大小的胶， l00V （大约50 mA) 大约3~4 小时。

    • ＊染色

  • 由于溴化乙锭已包含在样品缓冲液中，不需要进一步染色。

    • ＊分析

  • 核糖体亚基应该是分开的。除非上样太多，否则各亚基不应该分不清楚，如果不能分清意味着降解。
  • mRNA, 如果在胶上可见，看起来像是一片糊状。