石墨和锰矿对抗性基因的影响

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标题：Effects of graphite and Mn ore media on electro-active bacteria enrichment and fate of antibiotic and corresponding resistance gene in up flow microbial fuel cell constructed wetland

Hua Li, Han Xu, Yu-Li Yang, Xiao-Li Yang, You Wu, Shuai Zhang, Hai-Liang Song

DOI: https://doi.org/10.1016/j.watres.2019.114988

发表杂志：Water Research

1.研究背景

这项研究评估了基质类型对带有石墨和锰矿石电极基质的上流微生物燃料电池（UCW-MFC）中污染物去除，抗生素抗性基因（ARG）和细菌群落变化的影响。主要研究了目标抗生素（磺胺嘧啶（SDZ）和环丙沙星（CIP））的去除，石墨或锰矿石构造的UCW-MFCs的ARGs演化和发电特性。确定了锰矿石是否可以通过富集EABs来增强污染物去除能力和发电性能。然后，研究了优势细菌，产甲烷菌种群，EAB群落和潜在的ARG宿主细菌的变异。并研究环境因素和细菌群落组成对ARGs变异的贡献。

2.方法

2.1 室内建立以石墨和锰矿石为电极的UCW-MFC

2.2 将污泥泵入反应堆，运行一段时间后，通过液相色谱研究水质和基质中抗生素的累积

2.3 通过qPCR（引物由上海启因生物设计，Wcgene Shanghai, China）检测出水和基质中抗性基因

2.4 出水和基质中细菌群落分析

2.5 分析电极不同基质的发电特性

图1. 石墨构造的UCW-MFC（S）和锰矿石构造的UCW-MFC（Mn）的示意图（1. a蒲; 2。电阻; 3。石墨阴极; 4。锰矿石阴极; 5石墨阳极; 6锰矿石 阳极; 7电压采集卡; 8计算机; 9蠕动泵; 10入口）

3.结果

3.1 水质参数和底物化学性质

图2显示反应器在运行140天后的污染物去除效率，包括COD，NH 4 + -N和目标抗生素（SDZ和CIP）。

锰构造的UCW-MFC（Mn）COD去除率比石墨构造的UCW-MFC（s）高。然而，UCW-MFC（s）的NH 4 + -N去除率比UCW-MFC（Mn）更高。在去除SDZ方面，石墨反应器优于锰矿石反应器。此外，两个反应器对CIP的去除能力都很高。这些结果可归因于不同底物的吸附能力不同。

图2. 在整个实验期间，目标污染物的去除率包括（A）COD，（B）NH 4 + -N，（C）SDZ和（D）UCW-MFC和UCW-MFC（Mn）中CIP。

3.2 围隔实验期间出水和基质层中ARG的变化

出水中，UCW-MFC（Mn）的总相对丰度（RA）明显高于UCW-MFC（s）（图3A）。而电极基底上检测的结果正相反（图3B）。

在检测到的ARG中，sulI，qnrS和aac（6'）-ib-cr明显富集在石墨阳极上。总的ARG拷贝在UCW-MFC（Mn）的流出物中增加，在UCW-MFC（s）流出物中则下降了8.1％（图4A）。石墨基材构造的UCW-MFC（s）对细菌粘附效率更高，因此当从废水中去除目标ARGs时，ARG及其宿主细菌在石墨电极上的丰度增强（图4B）。

图3.在140天的运作期间检测到的（sulI，sulII，qnrS和acc（6'）-ib-cr）水平和一个整合子基因（intI）基因拷贝标准化为UCW-MFC和UCW-MFC（Mn中存在的16S rRNA基因的拷贝 ）反应堆。（A）出水中靶基因的相对丰度；（B）在基板层中的靶基因的相对丰度。

图4. 根据目标ARGs的自然对数转换后的绝对对数，在废水和电极中ARGs的分布的“热图”。（A）流出物中intI和四个ARG（sulI，sulII，qnrS和acc（6'）-IB-CR）的绝对拷贝的热图；（B）阳极和阴极基板的intI和四个ARG（sulI，sulII，qnrS和acc（6'）-IB-CR）的绝对拷贝的热图。

3.3 废水和底物中的细菌β多样性以及阳极底物上潜在的功能优势微生物

使用UPGMA聚类树基于门类级别的层次聚类分析（图5A）。总共观察到18个主要门，表明反应堆阳极上的生物多样性很高。PICRUSt分析结果进一步表明，细胞外电子转移相关功能基因的丰度增加，但UCW-MFC（Mn）阳极的产甲烷菌功能基因和多种抗生素抗性基因减少。

LEfse算法进一步揭示了主要的分类单元，显示了锰矿石和石墨阳极之间的主要区别（图6A）。在LDA阈值为2.0时发现了56个生物标记（图6B）。LEfse分析显示由于两个反应器中的底物差异，细菌群落显着不同，并且典型的模型电活性细菌（EAB）Geobacter在UCW-MFC（Mn）的阳极上大量富集。相反，产甲烷菌（Methanosaeta）的相对丰度受到抑制。

图5. 使用带有PICRUSt的16S rRNA标记基因序列，细菌和产甲烷菌的群落组成以及与甲烷单加氧酶相关的功能模块的变化以及向外或向内的细胞外电子转移。（A）在反应堆中阳极基底样品的门相对水平的相对丰度的聚类分析。（B）产甲烷菌的阳极组成。（C）由PICRUSt预测的甲烷单加氧酶基因在阳极上的相对丰度；（B）PICRUSt预测的向外或向内细胞外电子转移基因的相对丰度。

图6. 线性判别分析（LDA）与效应大小算法（LEfSe）分析相结合，显示石墨阳极和锰矿石阳极之间的不同生物标记。（A）石墨阳极和Mn矿石阳极的样品的复合图。（B）所有样品中丰富的生物标志物的LDA评分（绿色表示石墨阳极，红色表示锰矿石阳极）。

3.4 系统中主要产甲烷菌的丰度

两个电极底物上鉴定的主要产甲烷菌是甲烷菌属、甲烷亚磷菌属、甲烷八叠球菌属和甲烷杆菌属(图5B)。随着COD浓度增加，石墨阳极上甲烷单加氧酶的RA从8.28 * 10 -5增加到4.52 * 10 -4，锰矿阳极上的RA值从3.34 * 10 -5增加到6.08 * 10 -5（图5C）。石墨阳极上甲烷单加氧酶的活性始终显著高于锰矿阳极。相反，与石墨阳极相比，锰矿阳极上富集了EET功能基因(图5D)。

3.5 细菌群落，废水性质和ARGs发生率之间的RDA分析

图7的RDA分析揭示ARG的RA，主要门和主要环境因素之间的关系。废水的环境因素分析包括底物类型和抗生素，COD和NH 4 + -N浓度。SDZ质量，CIP质量和阳极上ARG的RA之间的显着正相关。

RDA分析表明，底物类型，抗生素积累和细菌群落是影响ARGs变异的主要因素，揭示了潜在的ARG宿主以及ARG和intI1的共现。

图7. 废水和阳极底物样品中主要细菌菌群，ARG和环境因素之间关系的冗余分析（RDA）。（A）废水样品；（B）阳极基板样品

3.6 通过网络分析揭示ARG及其潜在宿主之间的相关性

该网络由四个ARG，一个Integron基因（intI）和潜在的ARG宿主组成，网络分析揭示了污水和电极属水平的潜在宿主细菌（图8）。结果进一步证明这些ARG具有相同的宿主细菌，并且观察到它们的细菌宿主之间存在正相关。ARG，intI和一些潜在的抗生素抗性细菌同时存在，表明它们可以一起传播以增加环境风险。

图8 （A）流出物和（B）电极底物样品中ARG（相对丰度）与其潜在宿主细菌（16S rRNA基因OTU数据）之间的网络分析。

结论

我们的结果表明，电活性细菌Geobacter在锰矿石阳极上大量富集。 PICRUSt预测的甲烷生成功能基因在锰矿石阳极上减少。在UCW-MFC（Mn）中获得了更高的COD去除率和发电性能。ARGs及其宿主在从水相向底物的迁移过程被过滤。